Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.
Разновидности реакции агглютинации (РА ) для выявления AT - кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хаддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).
Ориентировочная реакция агглютинации (РА)
Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки.
Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.
О-Аг . Соматические О-Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты.
Н-Аг . Н-Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками).
Vi-Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60-62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi-антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.
Реакции прямой гемагглютинации
Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов.
Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов из них.
Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).
РИГА применяют в двух вариантах: с известными АГ для обнаружения АТ с известными АТ для выявления АГ. Эта реакция специфична, и применяют ее для диагностики заболеваний, вызванных бактериями и риккетсиями. Для проведения РИГА используют эритроцитарные диагностикумы, приготовленные путем адсорбции на эритроцитах АГ или АТ - в зависимости от цели исследования (рис. 10.3). В положительных случаях степень агглютинации эритроцитов отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеивающихся эритроцитов (зонтик), покрывающей дно пробирки; наличие пленки с фестончатыми кружевными краями обозначают двумя плюсами. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызывавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса.
Рис. 10.3.
1 - эритроциты, 2 - АГ эритроцита, 3 - конъюгированный АГ, 4-АТ
РГА и реакция торможения гемагглютинации (РТГА).
Как уже отмечалось, в основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных АГ. В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость, суспензию хорион-аллантоисных оболочек куриных эмбрионов, взвеси и экстракты из культур или органов животных, зараженных вирусами, нативный инфекционный материал. РГА не является серологической реакцией, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения АГ для постановки РТГА или наличия АГ (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека с I (0) группой крови. Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5%-й взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1-2 мин макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистироловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объеме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25-1%-й взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Четырьмя плюсами оценивают реакцию, имеющую вид тонкой пленки из склеившихся эритроцитов, покрывающей дно пробирки (зонтик), реакцию с просветами в пленке отмечают тремя плюсами, наличие пленки с фестончатыми кружевными краями из склеившихся эритроцитов обозначают двумя плюсами, хлопьевидный осадок эритроцитов, окруженный зоной комочков агглютинированных эритроцитов, соответствует одному плюсу. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля, показывает отсутствие агглютинации. За титр принимают предельное разведение исследуемого материала, вызвавшее агглютинацию эритроцитов на два плюса. При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью РТ ГА типоспецифическими сыворотками. РТГА основана на свойстве антисыворотки подавлять вирусную гемагглютинацию, так как нейтрализованный специфичными АТ вирус утрачивает способность агглютинировать эритроциты. При ориентировочном типировании вирусов используют капельный метод на стекле. Для окончательного установления типовой принадлежности выделенного вируса и титрования АТ в сыворотках ставят развернутую РТГА в пробирках или в лунках. С этой целью готовят двукратные разведения сывороток на физиологическом растворе и разливают по 0,25 мл. К разведениям сыворотки прибавляют по одной капле материала, содержащего вирус, и по одной капле 1%-й взвеси эритроцитов. При использовании РТГА для определения типа вируса используют типоспецифические сыворотки, которые добавляют к равному объему рабочего разведения АГ. Типовую принадлежность выделенного вируса устанавливают по специфической иммунной сыворотке, показавшей наивысший титр АТ к этому вирусу. РГА и РТГА широко применяются для диагностики вирусных инфекций (клещевого энцефалита, гриппа и др.) в целях обнаружения специфических АТ и для идентификации многих вирусов по их АГ.
РЕАКЦИЯ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ, РНГА
(Indirect hemagglutination test)
Метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов.
При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной гемагглютинацией - РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обнаружении антител - пассивной гемагглютинацией - РПГА (passive hemagglutination test). РНГА нашла широкое применение для выявления серологических маркеров инфицирования вирусом гепатита В , особенно HBsAg и антител к нему.
В настоящее время разработаны различные методы изготовления эритроцитарных диагностикумов, отличающихся по способам сенсибилизации эритроцитов (с помощью танина, глютарового альдегида, хлористого хрома, риванола и т.п.), их видовой принадлежности (человека, барана, курицы, индюка и т. д.), вариантам постановки реакции (в планшетах для микротитрования, в пробирках, капиллярах и т. д.) и учета результатов (визуальный и инструментальный). Эритроцитарные диагностикумы для выявления HBsAg и анти-HBs выпускаются многими предприятиями и фирмами как у нас в стране, так и за рубежом.
Чаще РНГА проводится в планшетах для микротитрования, в которых предварительно приготовляются разведения исследуемой сыворотки и контрольных образцов. После внесения эритроцитарного диагностикума и инкубации проводится учет результатов реакции. Положительными считают образцы, в которых происходит агглютинация эритроцитов, имеющая вид перевернутого “зонтика”. При отрицательной реакции - эритроциты оседают на дно лунки в виде кольца или диска.
Для подтверждения специфичности полученных результатов реакция ставится как с “опытным” эритроцитарным диагностикумом (т. е. эритроциты, сенсибилизированные антигеном или антителами), так и с “контрольным” диагностикумом (т. е. эритроциты не сенсибилизированы антигеном или антителами). Наличие позитивной реакции с “контрольным” диагностическим препаратом свидетельствует о ложнопозитивной реакции. Для устранения неспецифических реакций исследуемую сыворотку обрабатывают несенсибилизированными эритроцитами. Обязательным условием проведения РНГА является реакция нейтрализации, т. е. конфирмационный тест .
По сравнению с такими методами, как РПГ , ВИЭФ и РСК , реакция непрямой гемагглютинации обладает более высокой чувствительностью (в 200 - 400 раз). Так, HBsAg в РПГА может быть выявлен в концентрациях 6-10 нг/ мл. Простота проведения реакции и экспрессность (20 - 30 минут) определили широкое применение данного метода в службе переливания крови для выявления HBsAg.
Кроме эритроцитарных диагностикумов для выявления HBsAg и анти-HBs разработаны диагностические препараты и для вы- явления анти-НВс, анти-НВс класса IgM (твердофазный вариант), HBeAg, антигена вируса гепатита А и антител к нему, однако, все они не нашли применения в практическом здравоохранении.
Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).
Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:
- фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
- обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
- сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:
- к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
- смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
- учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.
РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.
РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:
- обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
- обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).
Реакцию проводят для обнаружения антигенов возбудителей в исследуемом материале, добавляя в нему иммунную сыворотку. При наличии гомологичного антигена происходит связывание антител, поэтому после добавления сенсибилизированных антигеном эритроцитов их агглютинации не происходит, что оценивается как положительный результат. Для большей чувствительности реакции специфическую иммунную сыворотку добавляют к исследуемому материалу в минимальном количестве (2 гемагглютинирующие единицы). Титр иммунной сыворотки определяют предварительно с помощью РНГА. За одну гемагглютинирующую единицу принимают предельное разведение сыворотки, которое вызывает склеивание эритроцитов.
Методика. В лунки полистироловых пластин или агглютинационные пробирки вносят по 0,025 мл 1% раствора нормальной сыворотки кролика и делают серийные 2-кратные разведения исследуемого материала. Затем во все лунки добавляют по 0,025 мл имунной сыворотки, пластинку встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 37ºС или на 1 ч при комнатной температуре. Далее во все лунки добавляют по 0,025 мл антигенного диагностикума, встряхивают и оставляют на 2 ч, после чего учитывают результаты.
При проведении этой реакции к контролю для РНГА добавляют контроль специфичности иммунной сыворотки, состоящий из специфического антигена, иммунной сыворотки (2, 1, 0,5 гемагглютинирующей единицы) и взвеси сенсибилизированных эритроцитов.
РТНГА применяют также для обнаружения специфических антител (полных и блокирующих), для чего к исследуемой сыворотке добавляют дозированное количество антигена. Если в ней содержатся антитела, то происходит связывание их антигеном, поэтому после добавления эритроцитов, сенсибилизированных антителами (2-й этап РТНГА), склеивания эритроцитов не происходит.
Благодаря использованию минимального количества антигена (2 нейтрализующие дозы) реакция высокочувствительна. Количество нейтрализующих доз в антигенном препарате определяют с помощью РНГА, при этом делают серийные 2-кратные разведения антигена в 1 % растворе нормальной сыворотки кролика и в лунки вносят антительный эритроцитарный диагностикум. Нейтрализующей дозой антигена считают его максимальное разведение, дающее полное склеивание сенсибилизированных эритроцитов.
Перед проведением реакции испытуемые сыворотки разводят 1:5-1:10 и инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Для адсорбции гемагглютининов к сывороткам добавляют 50 % взвесь формалинизированных или свежих отмытых эритроцитов барана из расчета 0,1 мл взвеси на 1 мл разведенной сыворотки. Смесь встряхивают и инкубируют 30 мин при температуре 37ºС или 1 ч при комнатной температуре, после чего эритроциты осаждают центрифугированием. Можно для осаждения эритроцитов оставить сыворотки в холодильнике до следующего дня.
При проведении опыта исследуемый материал разводят в 1 % растворе нормальной сыворотки кролика в объеме 0,025 мл в лунках панели микротитратора. Затем в каждую лунку добавляют по 2 нейтрализующих дозы антигена в объеме 0,025 мл. Пластины встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 37 °С или на 1 ч при комнатной температуре. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл антительного эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и инкубируют 1,5-2 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результаты реакции. Учет можно производить также и на следующий день. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное разведение ее, в котором не происходит склеивания эритроцитов.
Опыт сопровождают следующими видами контроля:
1) стабильности сенсибилизированных эритроцитов (эритроциты +1 % раствор нормальной сыворотки кролика);
2) полноты истощения гемагглютининов в каждой испытуемой сыворотке (испытуемая сыворотка в наименьшем разведении + формалинизированные эритроциты);
3) правильности определения минимальной нейтрализующей дозы антигена (2, 1 и 0,5 нейтрализующей дозы антигена + антительный эритроцитарный диагностикум).
Реакция обратной непрямой гемагглютинации (ронга) применяется для индикации бактериальных и вирусных антигенов в исследуемых материалах, а также для экспресс-диагностики ряда инфекций.
В отличие от РНГА при данной реакции эритроциты сенсибилизируют не антигеном, а антителами, агглютинация которых происходит при добавлении антигена.
Эритроциты предварительно фиксируют формалином, или глютаральдегидом, а затем связывают их с гамма-глобулином, который выделяют из иммунных сывороток и очищают от других сывороточных белков. Связывание гамма-глобулина с поверхностью эритроцитов происходит с помощью хлорида хрома. Для этого к 8 объемам дистиллированной воды добавляют 1 объем иммуноглобулинов, выделенных из иммунной сыворотки, 1 объем 50 % взвеси формалинизированных эритроцитов и 1 объем 0,1-0,2 % раствора хлорида хрома. Смесь оставляют на 10-15 мин при комнатной температуре, затем обрабатывают эритроциты как при реакции пассивной гемагглютинации.
Специфичность антительного диагностикума проверяют в реакции торможения пассивной гемагглютииации гомологичным антигеном. Реакция должна тормозиться гомологичным антигеном не менее чем в 16 раз и не тормозиться гетерологичным. Используется контроль на отсутствие спонтанной гемагглютинации.
С помощью этой реакции проводят индикацию возбудителей в материале, взятом из органов погибших людей и животных, например, из мозга, селезенки, печени легких. Готовят 10 % суспензию указанных органов на изотоническом растворе натрия хлорида, центрифугируют их в течение 30-60 мин при 10000 об/мин и используют надосадочную жидкость в качестве антигена.
Методика. Готовят 2-кратные разведения исследуемого материала (антигена) на стабилизирующем растворе. Вносят по 1 капле каждого разведения антигена в 3 соседние лунки микропанели (реакция занимает 3 параллельных ряда лунок). В каждую лунку первого ряда добавляют по 1 капле стабилизирующего раствора, в лунки второго ряда – по 1 капле гомологичной иммунной сыворотки в разведении 1: 10, третьего ряда – по 1 капле гетерологичной иммунной сыворотки. Второй и третий ряды служат контролями специфичности реакции. Смесь оставляют на 20 мин при комнатной температуре.
Во все лунки добавляют по 1 капле 1 % суспензии сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарный антительный диагностикум) и тщательно встряхивают пластины. Результаты реакции учитывают через 30-40 мин. При наличии специфического антигена гемагглютинация отмечается в первом и третьем ряду (с гетерологичной сывороткой) и отсутствует во втором ряду, где антиген предварительно нейтрализован гомологичной сывороткой.
Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на спонтанную агглютинацию.
Реакция торможения обратной непрямой гемагглютинации (РТОНГА) позволяет определить наличие антител в сыворотках людей и животных.
Методика. Сыворотки разводят в 10 раз изотоническим раствором натрия хлорида, прогревают 20 мин при температуре 65 °С для разрушения неспецифических ингибиторов, а затем готовят 2-кратные разведения сывороток на стабилизирующем растворе и рабочую дозу антигена, содержащую 4 агглютинирующие единицы. Вносят по 1 капле каждого разведения сыворотки в лунки микропанели и добавляют в них по 1 капле антигена, разведение которого соответствует рабочей дозе. После контакта компонентов смеси в течение 20 мин при комнатной температуре во все лунки вносят по 1 капле эритроцитарного антительного диагностикума и тщательно встряхивают. Через 1,5-2 ч инкубации при комнатной температуре по гемагглютинации учитывают результаты реакции. Титром сыворотки является ее наибольшее разведение, которое полностью тормозит реакцию гемагглютинации с четырьмя агглютинирующими единицами антигена.
Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на спонтанную агглютинацию в присутствии: а) стабилизирующего раствора; б) нормального антигена (из материала, не содержащего вирус); в) исследуемой сыворотки. Преимущество реакции заключается в ее универсальности и возможности использования для выявления различных антигенов.
Оценка результатов гемагглютинации. Результаты РНГА, РОНГА и РТОНГА учитывают по степени агглютинации эритроцитов: (++++) – полная агглютинация; (+++) – менее полная агглютинация; (++) – частичная агглютинация; (+) – следы агглютинации; (–) – отсутствие агглютинации.
Реакция считается положительной, если агглютинация полная (++++) или почти полная (+++), диагностикум не дает спонтанной агглютинации в присутствии каждого компонента реакции и контроль специфичности антигена или антитела положительный.
Загрузка...